产品货号：
GS0137
中文名称：
高效感受态细胞制备试剂盒
英文名称：
High-efficiency Competent Cell Preps Kit
产品规格：
40T|200T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒采用了一种简单而可靠的方法制备感受态细胞，由该试剂盒制备的感受态细胞在进行转化时无需经过热激步骤，对于Ampicillin抗性质粒而言，甚至连活化步骤都可以省略，感受态细胞和DNA混合后即可直接涂布，极大地简化了转化过程，提高了实验效率。用该试剂盒制备的大肠杆菌DH5α细胞使用pUC19质粒DNA转化，转化率可以达到107～109cfu/μg DNA，对其他常用的工程菌株和质粒也同样适用。
- 感受态制备流程快速简单。
- 转化过程无需热激。
- 转化效率高达107～109cfu/μg DNA。
- 使用感受态专用培养基，最大化感受态效率。
- 适合大量制备。
| 组分 | 40T | 200T | 保存 |
| BT Buffer F | 10mL | 5×10mL | 4℃ |
| BT Buffer E | 4mL | 5×4mL | 4℃ |
| BT Media(50mL) | 2个 | 10个 | 室温密封干燥 |
保存：4℃
一、高效感受态细胞制备流程
- 准备工作：
- 自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50mL离心管、冰等。
- BT Media培养基准备：1支BT Media加50mL蒸馏水中，高压灭菌即可。
- 将BT Buffer F和BT Buffer E放冰上预冷，预冷低温离心机至4℃。
- 自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50mL离心管、冰等。
- 操作步骤：
- 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线培养，置37℃培养箱中静置培养12～16h待菌落生长至直径1～2mm大小。
- 挑取一个生长正常的菌落，接种至10～15mL液体LB培养基中，于37℃摇床充分振荡（≥ 250rpm）培养12～16h。
- 取上述活化好的菌液0.5mL接种至准备好的50mL BT Media中，于37℃摇床充分振荡培养至菌液OD600=0.4～0.6。
- 50mL培养物请使用容量大于250mL的锥形瓶，同时摇床转速超过250rpm以保证充气充分。
- 使用较低的温度（18～26℃）培养细菌将使感受态效率进一步提高一个数量级，室温状态下菌液培养至OD600=0.4～0.6需要10～36h。
- 50mL培养物请使用容量大于250mL的锥形瓶，同时摇床转速超过250rpm以保证充气充分。
- 将菌液转移至50mL聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min。
- 3500～5000rpm离心5min收集菌体沉淀。
- 倒掉上清，每50mL培养物菌体沉淀用5mL冰上预冷的BT Buffer F轻柔充分重悬菌体，冰上放置10～15min。
- 于4℃，3500～5000rpm离心2～5min收集菌体沉淀。
- 每50mL培养物菌体沉淀用2mL冰上预冷的BT Buffer E轻柔充分重悬菌体，按每管100μL分装至冰上预冷的1.5mL离心管中。
- 菌体直接用于转化或用液氮速冻后于超低温冰箱中保存。
注：制备好的感受态可于冰上保存48h，-70℃保存有效期为6个月。
- 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线培养，置37℃培养箱中静置培养12～16h待菌落生长至直径1～2mm大小。
二、标准转化步骤
- 准备工作：
- 自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
- 调节水浴锅至42℃，将活化用的LB或SOC培养基预热至37℃，将含相应抗生素的平板预热至37℃。
- 自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
- 操作步骤：
- 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
注：新鲜制备的感受态细胞可以在冰上保存0-48h，直接使用。 - 每管感受态加入100pg～10ng待转化DNA或连接产物，轻柔混匀，于冰上静置30min。
- DNA体积不超过感受态细胞体积的5%。
- 冰上静置时间少于15min将降低转化效率。
- 此处可设置用无菌水代替DNA进行转化的对照组1（见附录）。
- DNA体积不超过感受态细胞体积的5%。
- 将离心管置42℃水浴锅中孵育45～90sec，取出后立即冰上放置2～3min。
注：热激时请勿搅动。 - 加入800～900μL预热至37℃的不含抗生素的LB或SOC培养基，颠倒混匀。
- 于37℃摇床缓慢振荡培养45～60min。
注：摇床转速不超过220rpm。 - 取适量菌液涂布至与目标质粒抗性相应的LB平板中，于37℃培养箱中倒置培养过夜（12-16h）。
- 此处可将菌液涂布一份至不含抗生素的平板上，作为对照组2。
- 分别取不同的菌液量，如1～2μL、10～20μL、100～200μL涂布平板以避免转化子太多导致难以挑斑的情况。
- 如果需要进行蓝白斑筛选，在培养基中加入终浓度为40μg/mL的X-gal和1mmol/L的IPTG。
- 使用百奥莱博的平板涂布专用玻璃珠(货号：GS0140)进行涂布可以比传统涂布方法获得更多转化子。
- 此处可将菌液涂布一份至不含抗生素的平板上，作为对照组2。
- 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
三、快速转化步骤（不经过热激的转化步骤）
- 准备工作：
- 自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
- 将含合适抗生素的LB平板预热至37℃。
- 自备材料：LB培养基、LB平板、合适抗生素、待转化质粒或连接产物等。
- 操作步骤：
- 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
- 每管感受态加入100pg～10ng待转化DNA，用枪头轻柔混匀，于冰上静置10min。
- 加入1mL预热至37℃不含抗生素的LB或SOC培养基，混匀。于37℃摇床缓慢振荡培养45～60min。
注：对于使用Ampicillin筛选而言，该步骤可以省略，可以直接将感受态和DNA的混合溶液涂布至含有抗生素的平板上。 - 取适量菌液涂布至含有与目标质粒抗性相应的抗生素的LB平板中，37℃培养箱中倒置培养过夜。
- 将从超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化。
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